· polyakrylamidgel måste av akrylamidmonomer, polymerisationsutgångsmaterial, katalysator och höger salt och buffertblandning tillsammans.
· akrylamidoch BIS (N,N'-metylendubbelakrylamid) är den monomera formen av gelmatris.
· ammoniumpersulfat starta limpolymerisationsprocessen. Formuleringen av limet kräver 10% ammoniumpersulfatlösning framställd i vatten. Merparten av informationen tydde på ett behov av aktiv användning. Emellertid kan 10%-lösningen placeras vid 4 ℃ i flera veckor utan betydande förlust av aktivitet. Fyll på upp till 10 ml och kassera när limet inte hopar sig.
Tips: Procentandelen avakrylamidi sekvensering lim och protein lim är inte samma sak. Om du använder färdiggjord akrylamid: BIS-lösning, se till att få rätt flaska.
· TEMED (N, N, N', N'-tetrametyletylendiamin) är en katalysator, i en brun flaska, placerad i kylskåp. Tillsätt precis innan du häller lim.
· polyakrylamidelektrofores som används vid elektrofores ska tvättas före och efter varje gång. Efter elektrofores, tvätta med en mjuk borste och trasa i varmt tvålvatten, skölj med destillerat vatten och låt torka.
· fukt och damm kan orsaka med ihålig polymer. Före elektrofores, rengör glasplattan med glasrengöringsmedel och torka av den med en mjuk borste. Tvätta med destillerat vatten och torka ordentligt med en pappersservett. Sköljning med 70 % etanol innan avtorkning med papper hjälper till att rengöra och påskynda torkningen. Tillsätt prover av akrylamid successivt: BIS, vatten, buffertlösning, ammoniumpersulfat, TEMED. Skaka väl och häll omedelbart.
Det är inte nödvändigt att avgasa polyakrylamid före polymerisation. (Akrylamid användes för att placeras i ett vakuum för att avlägsna bubblor eftersom syre hämmar polymerisation.)
Horisontella limpunkter provspetsar.
· lägg en bit svart papper i den nedre rutan, svart bakgrund för att göra ett provhål för att se tydligare.
· limtank fylld buffert, strax över kolloiden.
· om kanten har ett ljus, slå på ljuset, låt ljuset lysa kolloid. Dra in provet i pipetten.
· med automatisk pipettering.
· i 10-200 mu 1 flytande punkt kan användas i de flesta punkterna på provet. För mycket små provhål (mindre än 10μ1) är det långa pipetthuvudet som används för sekvensering av lim mer bekvämt.
· pipettera precis nedsänkt i provet, andas in långsamt rörlig vätska. Provet kan verka klibbigt av glycerin och snabb pumpning kan dra in luftbubblor i pipetthuvudet.
· prover efter inandning av pipettering huvudet, kommer att flytta vätskehuvudet försiktigt på kanten av röret eller torka papper suger vätskehuvudet utanför dropparna. Var noga med att inte suga provet.
Placera provet i provhålet
· pipettering anordning för att hålla ett litet tryck, gör proverna något flytta översvämning vätskehuvudet.
· pipetteringshuvudet som förs in i bufferten, något högre än punkthålen, bibehåller positivt tryck. Pipettens spets kan föras in i ett litet hål.
· långsamt och stadigt tar proverna ut. Pipettspetsen placeras ovanför punktprovshålet och provet kommer att sjunka ner i hålet. Låt provet sjunka för att fylla provhålet istället för att trycka in det.
· när den sista droppen av provet med vätskehuvudet, kommer vätska att flytta till det andra benet, långsamt höja vätskan flytta, flytta ut ur bufferten
Hur gör man vertikal limprovtagning?
· vertikala limpunktsprovhål bildade mellan två glasbitar. I mycket tunt lim kan pipetthuvudet inte ens föras in mellan två glasskivor. Titta på glycerinet! Sätt pipetthuvudet över provhålet och provet kommer att sjunka ner i hålet.
· punkt prov innan, var noga med att sätta den vertikala punkten av polypropylen acyl gel prov hålet sköljs rent. Tvätta bort den opolymeriserade akrylamiden och vattnet som kan dyka upp i botten av provhålet. Vattnet kan göra provhålet betydligt mindre. Använd en 25 ml eller 50 ml spruta och en 18-gauge nål. Häll i elektroforesbufferten och spola försiktigt provhålet.
· det kan vara svårt att se provhålet, men samtidigt är resten lätt. Om det finns överskott av hål kan provbufferten testas med bromfenolblått.
Posttid: Mar-31-2023