· polyakrylamidGelen måste bestå av akrylamidmonomer, polymerisationsutgångsmaterial, katalysator och rätten till salt- och buffertblandning tillsammans.
· akrylamidoch BIS (N,N'-metylendubbelakrylamid) är monomerformen i gelmatris.
· ammoniumpersulfatstartpolymerisationsprocess för limmet. Limmets formulering kräver 10 % ammoniumpersulfatlösning beredd i vatten. Merparten av informationen indikerade ett behov av aktiv användning. Emellertid kan 10 %-lösningen placeras vid 4 ℃ i flera veckor utan betydande aktivitetsförlust. Fyll upp till 10 ml och kassera när limmet inte aggregerar.
Tips: Procentandelen avakrylamidVid sekvensering är lim och proteinlim inte samma sak. Om du använder en färdig akrylamidlösning: BIS, se till att du får rätt flaska.
· TEMED (N,N,N',N'-tetrametyletylendiamin) är en katalysator i en brun flaska som placeras i kylskåpet. Tillsätt strax innan limmet hälls.
· Polyakrylamidelektrofores som används vid elektrofores bör tvättas före och efter varje användning. Efter elektrofores, tvätta med en mjuk borste och trasa i varmt tvålvatten, skölj med destillerat vatten och låt torka.
· Fukt och damm kan orsaka irritation med ihålig polymer. Rengör glasplattan med glasrengöringsmedel och torka av den med en mjuk borste före elektrofores. Tvätta med destillerat vatten och torka noggrant med en pappersservett. Sköljning med 70 % etanol innan avtorkning med papper hjälper till att rengöra och påskynda torkningen. Tillsätt akrylamidprover i tur och ordning: BIS, vatten, buffertlösning, ammoniumpersulfat, TEMED. Skaka väl och häll omedelbart.
Det är inte nödvändigt att avgasa polyakrylamid före polymerisation. (Akrylamid placerades tidigare i vakuum för att avlägsna bubblor eftersom syre hämmar polymerisation.)
Provspetsar för horisontella limpunkter.
· Lägg en bit svart papper i den nedre lådan, med svart bakgrund för att göra ett provhål så att man kan se tydligare.
· buffertfylld med limbehållare, precis över kolloiden.
· Om kanten lyser, tänd lamporna och låt ljuset lysa kolloidalt. Dra upp provet i pipetten.
· med hjälp av automatisk pipetteringsanordning.
· i 10-200 μ1 kan en vätskerörelsepunkt användas i de flesta punkter på provet. För mycket små provhål (mindre än 10μ1) är det längre pipetthuvudet som används för sekvenseringslim mer praktiskt.
· pipettering som bara är nedsänkt i provet, inhalering av långsamt rörande vätska. Provet kan verka klibbigt av glycerin, och snabb pumpning kan dra in luftbubblor i pipetthuvudet.
· Efter inhalering av proverna kommer pipetteringshuvudet att röra vätskehuvudet försiktigt längs kanten av röret eller avtorka med ett papper för att suga vätskehuvudet utanför dropparna. Var försiktig så att du inte suger in provet.
Placera provet i provhålet
· Pipetteringsanordning för att bibehålla ett litet tryck, få proverna att röra sig något och överfyllda vätskehuvud.
· pipetteringshuvudet som sätts in i bufferten, något högre än punkthålen, bibehåller positivt tryck. Pipettspetsen kan föras in i ett litet hål.
· långsamt och stadigt ut proverna. Pipettspetsen placeras ovanför det punkterade provhålet, och provet sjunker ner i hålet. Låt provet sjunka för att fylla provhålet istället för att trycka in det.
· När den sista droppen prov med vätskehuvud kommer ut, kommer vätskan att röra sig till det andra benet, höj långsamt vätskans rörelse och rör sig ut ur bufferten.
Hur gör man vertikal limprovtagning?
· vertikala provhål med limpunkt bildade mellan två glasbitar. I mycket tunt lim kan pipetthuvudet inte ens föras in mellan två glasplattor. Se upp med glycerinet! Placera pipetthuvudet över provhålet så sjunker provet ner i hålet.
· Se till att den vertikala punkten på provhålet av polypropylenacylgel sköljs rent innan provet sköljs rent. Tvätta bort opolymeriserad akrylamid och vatten som kan finnas i botten av provhålet. Vattnet kan göra provhålet betydligt mindre. Använd en 25 ml eller 50 ml spruta och en 18-gauge nål. Häll i elektroforesbufferten och spola noggrant provhålet.
· Det kan vara svårt att se provhålet, men resten är ändå enkelt. Om det finns för många hål kan provbufferten testas med bromfenolblått.
Publiceringstid: 31 mars 2023